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姓名：劉丹丹；唐彤彤；陳炎
工作單位：江蘇康緣藥業股份有限公司
完成時間：2019年05月
甲磺酸帕珠沙星說明書
劉丹丹;唐彤彤；陳炎；周換換；霍艷萍；高曉艷
（江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222047）
摘要：目的：建立一種快速靈敏檢測注射用甲磺酸帕珠沙星含量的HPLC方法。方法：采用C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-磷酸三乙胺溶液（0.5%磷酸，1%三乙胺）=（15:85）；流速1.0ml/min，檢測波長為248nm，柱溫30℃。結果：帕珠沙星在10.1992μg/ml～101.992μg/ml范圍內，呈良好的線性關系（r=0.9999）,回收率為99.5%,RSD為0.3%。結論：HPLC可以迅速、準確地檢測出注射用甲磺酸帕珠沙星的含量。該方法的穩定性、重復性良好，可作為注射用甲磺酸帕珠沙星質量分析控制方法。
關鍵詞：帕珠沙星 含量測定 高效液相色譜法
Determination of Pazufloxacin Mesylate for Injection by high-performance liquid chromatography
Liu Dan-dan,Tang Tong-tong,chen yan,Zhou Huan-huan,HuoYan-ping,Gao Xiao-yan
（Jiangsu Kanion Pharmaceutical Limited by Share Ltd, Lianyungang 222047, Jiangsu China）
Abstract：Objective To establish a rapid and sensitive high-performance liquid chromatography(HPLC) method for detecting Pazufloxacin Mesylate for Injection . Methods: The analysis was carried out on C18 column (250mm x 4.6mm, 5μm).The mobile phase for pazufloxacin was a mixture of acetonitrile and 0.5% phosphoric acid containing 1% trethylamine （15：85),ang 5ul of theresulting solution was injected into the HPLC system at a flow rate 1.0 ml/ min . The detection wavelength was set at 248 nm and the column temperature was set at 30 ℃. Results:The liner range of pazufloxacin mesilate was 10.1992 μg/ml～101.992μg/ml, Show a good linear relationship (r = 0.9999).The average recovery (n=9）was 99.5%, RSD was 0.3% . Conclusion: HPLC is both sensitive and selective for Pazufloxacin Mesylate for Injection. The stability of the method, good repeatability，and can be used for Pazufloxacin Mesylate for Injection quality control are analyzed.
Key words ：Pazufloxacin；Determination ；HPLC
注射用甲磺酸帕珠沙星的主要成分是甲磺酸帕珠沙星，為帕珠沙星的甲磺酸鹽。甲磺酸帕珠沙星是新一代的喹諾酮類抗菌藥物，由日本化學公司和綠十字公司聯合開發,于2002年04月在日本獲準上市,是一種廣譜抗菌劑，作用靶位是細菌DNA拓撲異構酶II和IV ,通過抑制細菌DNA拓撲異構酶Ⅱ和Ⅳ的活性,從而抑制細菌DNA的合成,而導致細菌的死亡[1]。作為新一代的喹諾酮類抗菌藥物甲磺酸帕珠沙星比原來的喹諾酮類抗菌藥物具有更強的抗菌活性、更廣泛的抗菌譜和更好的耐受性，而且其光毒性明顯降低[2]。本品適用于敏感細菌引起的慢性呼吸道疾病繼發感染、腎盂腎炎、復雜性膀胱炎、前列腺炎、燒傷創面感染、外科傷口感染、膽囊炎、膽管炎、腹腔內膿腫、腹膜炎、生殖器官感染等疾病。臨床上主要用于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的呼吸道、泌尿道和皮膚組織感染，特別是對復雜性感染、急性感染、重度感染、手術及外傷感染和對一般抗感染藥有耐藥性的細菌有較好的療效，而對中樞神經系統的副作用較小[3]。目前注射用甲磺酸帕珠沙星含量測定的方法是紫外—可見分光光度法，而高效液相色譜法具有高壓、高速、高效、高靈敏度、應用范圍廣、重復性、精密度、靈敏度更高等特點，為制劑含量測定的首選方法。為了更好的控制注射用甲磺酸帕珠沙星的質量，建立了該藥的HPLC含量測定方法。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（檢測器為紫外檢測器），G1314A VWD紫外檢測器，所用軟件為ChemStation色譜工作站。Milli-Q Advantage A10 超純水機，Satorius ME5電子分析天平，JKQ-250DC型數控超聲清洗器。
1.2 試藥 注射用甲磺酸帕珠沙星（江蘇康緣藥業股份有限公司，規格0.5g，批號170101、170102、180101、180102、180501、180502、190201、190202、190203、190204）；帕珠沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號130460-201302，以C16H15FN2O4計，含量為76.6%）；乙腈為色譜純（美國Tedia AS-1122）；磷酸為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；三乙胺為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。
2 方法學考察【4】與結果
2.1 色譜條件
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（250×4.6mm,5μm）；流動相：乙腈-磷酸三乙胺溶液（0.5%磷酸，1%三乙胺）=15:85【5】；流速：1.0ml/min；檢測波長：248nm；柱溫：30℃；進樣量：5μl。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取帕珠沙星對照品適量（約相當于帕珠沙星10mg），置50ml容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取5ml至20ml量瓶中，用水稀釋制成每1ml中約含帕珠沙星50ug的溶液，作為對照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備
取本品10瓶，傾出內容物，將內容物研細并混合均勻，精密稱取對照品（約相當于帕珠沙星50mg），置100ml容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取5ml至50ml量瓶中，用水稀釋制成每1ml中約含帕珠沙星50ug的溶液，作為供試品溶液。
2.4 專屬性考察
陰性對照溶液的制備：按照處方配比取輔料適量，按2.3供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取對照品溶液，陰性對照溶液、供試品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，測定。
結果表明輔料不干擾主藥的含量測定，見圖1。
陰性對照溶液液
對照品溶液
供試品溶液
圖1 陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液
2.5 線性關系試驗
精密稱取帕珠沙星對照品適量，按照2.2對照品溶液制備制得濃度為101.992μg/ml作為儲備液，將儲備液分別稀釋成制成濃度為10.1992μg/ml、30.5976μg/ml、50.996μg/ml、81.5936μg/ml、101.992μg/ml的溶液，進樣5μl，以進樣質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得帕珠沙星回歸方程為Y=26.037X-4.7398,r=0.9999。
結果表明帕珠沙星在10.1992μg/ml～101.992μg/ml范圍內呈良好線性關系，見圖2。
圖2 帕珠沙星標準曲線
2.6 精密度試驗
取帕珠沙星對照品溶液重復進樣6次，計算峰面積RSD值為0.3%，結果表明精密度良好，見表1。
表1 精密度結果
序號
峰面積
平均值
RSD（%）
1
1386.0
1385.4
0.3
2
1388.1
3
1390.4
4
1383.9
5
1377.3
6
1387.0
2.7 重復性試驗
取樣品，按2.3制備供試品溶液方法制備，平行制備6份，測定，結果帕珠沙星的平均含量為99.1%，RSD=0.4%，試驗結果表明該方法重復性良好，見表2。
表2 重復性結果
序號
含量（%）
平均值（%）
RSD（%）
1
99.2
99.1
0.4
2
98.5
3
99.1
4
99.4
5
98.7
6
99.5
2.8 穩定性試驗
取供試品溶液，室溫放置，按上述方法分別在第0、2、4、8、12、24小時進行測定，結果帕珠沙星平均含量為98.9%，RSD值為0.5%，表明該溶液在24小時內穩定良好，見表3。
表3 穩定性結果
時間（h）
含量（%）
平均值（%）
RSD（%）
1
99.6
98.9
0.5
2
98.8
4
99.2
8
98.5
12
99.0
24
98.4
2.9 回收率試驗
取已知含量的樣品（帕珠沙星含量: 99.1%）九份，每份取約0.6g，分別按80%、100%和120%加入對照品，按2.3制備供試品溶液，分別精密吸取5μL，注入液相色譜儀，測定，計算加樣回收率，見表4。
表4 回收率試驗結果（n=9）
序號
樣品含量mg
加標量mg
測得量mg
回收率（%）
平均回收率（%）
RSD(%)
1
11.925
9.556
21.546
99.23
99.5
0.3
2
11.917
9.584
21.519
99.25
3
11.921
9.578
21.585
99.26
4
12.064
11.453
23.279
99.79
5
12.007
11.500
23.303
99.77
6
12.078
11.532
23.352
99.78
7
11.850
14.012
25.921
99.79
8
11.830
13.881
25.768
99.77
9
11.845
14.358
26.211
99.78
2.10 樣品測定
取10批樣品，按2.3制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀進行測定，計算結果；與原方法紫外分光光度法的測定結果進行比較，結果基本一致，表明該方法具有較高的準確度，見表5。
表5 樣品測定結果
批號
HPLC含量（%）
UV含量（%）
RSD（%）
170201
99.4
99.7
0.21
170202
98.2
98.5
0.22
180201
103.6
103.2
0.27
180202
100.0
99.4
0.43
180101
102.4
102.8
0.27
180102
98.3
98.0
0.22
190201
99.1
98.6
0.36
190202
101.2
101.5
0.21
190203
98.4
98.0
0.29
190204
97.1
96.8
0.22
3 討論
3.1 測定波長的選擇
甲磺酸帕珠沙星對照品溶液在200～400nm之間進行紫外光譜掃描[6]，結果顯示帕珠沙星在248nm處有最大吸收峰，考因此，選擇248nm波長作為檢測波長，見圖2。
圖2 紫外光譜圖
3.2 流動相的選擇通過查閱相關資料[4-10]，確定了三種流動相進行測定，這三種流動相分別是0.1%磷酸溶液-乙腈（85:15）、1%醋酸溶液-乙腈（85:15）以及磷酸三乙胺溶液（0.5%磷酸，1%三乙胺）-乙腈（85:15）。測定的結果顯示流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（85:15）的帕珠沙星出峰時間為2.848min，出峰時間太早，會有溶劑峰干擾；流動相為1%醋酸溶液-乙腈（85:15）的帕珠沙星出峰時間為3.636min，出峰時間同樣太早，也會有溶劑峰干擾；流動相為（磷酸三乙胺溶液（0.5%磷酸，1%三乙胺）-乙腈（85:15）的帕珠沙星出峰時間為9.902min，出峰時間合適，對稱因子為1.01。所以最終確定磷酸三乙胺溶液（0.5%磷酸，1%三乙胺）-乙腈（85:15）為流動相。3.3 色譜柱和柱溫的選擇3.3.1在色譜柱的選擇中，我們選擇不同廠家型號的色譜柱進行測定，結果見表6。由表6得出不同廠家不同品牌的色譜柱適用性均良好，色譜柱最終確定為C18柱。表6 色譜柱對比結果
序號
色譜柱品牌
色譜柱參數
理論塔板數
拖尾因子
1
Kromasil
C18，250mm×4.6mm，5μm
11389
1.00
2
Thermo
HYPERSIL C18，250mm×4.6mm，3μm
13403
1.01
3
Agilent
ZORBAXEclipseXDB C18,
250mm×4.6mm，5μm
15686
1.00
4
Phenomenon
Luna C18, 250mm×4.6mm, 5 μm
13890
1.01
3.3.2在柱溫的選擇中，我們選擇了20℃、30℃、40℃這三個溫度點進行測定，結果見表7。30.0℃和40.0℃的柱效都良好，但是考慮到溫度越高對樣品穩定性有影響，綜合考慮選擇柱溫30.0℃。表7 柱溫對比結果
序號
柱溫（℃）
理論塔板數
對稱因子
1
20.0
10426
1.10
2
30.0
12374
1.01
3
40.0
12745
1.01
3.4 建立了高效液相色譜法測定注射用甲磺酸帕珠沙星含量的新方法，該方法具有簡單、快速、靈敏度高，線性范圍良好等特點。采用此方法測定了10批注射用注射用甲磺酸帕珠沙星的含量并與原標準方法紫外分光光度法的測定結果進行比較，其測定結果基本一致，表明該方法具有較高的準確度。參考文獻
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